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P-TEFb激酶复合体在常染色体显性多囊肾病中的作用及机制研究

作者:孙永占 等 日期:2019-10-08 浏览量:23

七届北京罕见病学术大会暨2019京津冀罕见病学术大会征文(98)

天津医科大学生物化学与分子生物学系

孙永占、刘志恒、曹心怡、鲁毅、陈宇鹏

目的:阐释P-TEFb激酶复合体在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)中的作用及其发挥作用的分子机制,探究药物靶向抑制P-TEFb激酶复合体对ADPKD的治疗效果。

方法:利用小鼠胚肾囊肿发生模型筛选抑制囊肿生长的小分子化合物;利用MDCK细胞囊肿发生模型,检测P-TEFb激酶抑制剂Flavopiridol以及基因沉默P-TEFb复合体对囊肿生长的影响;通过Western免疫印迹、免疫荧光染色、和激酶反应分析ADPKD小鼠以及病人肾组织中P-TEFb激酶复合体的表达水平及其激酶活性;通过Flavopiridol处理检测抑制P-TEFb激酶活性对中期和长期ADPKD小鼠囊肿生长的影响;通过蛋白和RNA免疫共沉淀、蔗糖密度梯度离心、体内体外激酶活性分析检测cAMP/PKA信号通路调控P-TEFb激酶复合体的组装及其动态平衡;通过斑马鱼囊肿发生模型检测P-TEFb激酶复合体动态平衡变化对囊肿发生的影响;通过ChIP-Seq和RNA-Seq技术鉴定P-TEFb激酶促进囊肿发生的作用靶点及作用机制。

结果:结合小鼠胚肾囊肿模型以及小分子化合物库筛选,我们发现Flavopiridol显著抑制囊肿发生。体外MDCK细胞囊肿发生模型的结果表明,Flavopiridol或者P-TEFb激酶复合体蛋白敲减可以显著抑制囊肿生长。ADPKD小鼠和病人肾脏标本分析结果表明,相对于正常对照组,P-TEFb激酶活性显著升高。体内药物处理实验表明,Flavopiridol可有效抑制ADPKD小鼠肾囊肿上皮细胞增生,降低炎症反应、减缓纤维化进程,进而明显改善小鼠肾脏功能。生化、分子生物学以及斑马鱼体内实验结果表明,ADPKD中过度活化的cAMP/PKA信号通路直接磷酸化P-TEFb复合体的抑制分子HEXIM1(158位丝氨酸),HEXIM1磷酸化导致P-TEFb复合体激活,进而促进囊肿发生。ChIP-Seq、RNA-Seq联合生物信息学分析结果表明,活化的P-TEFb激酶复合体特异性地上调一系列囊肿发生基因的表达。

结论:在ADPKD中,过度活化的cAMP/PKA信号通路可通过激活P-TEFb激酶复合体,上调ADPKD细胞中囊肿发生相关基因的表达,加速囊肿细胞增殖,促进疾病进展。抑制P-TEFb激酶活性可以有效延缓ADPKD的进程,改善肾脏功能。