第七届北京罕见病学术大会暨2019京津冀罕见病学术大会征文（297)

1北京大学第一医院 儿科

2北京大学医学部 基础医学院心血管研究所

范燕彬1 谈丹丹1 张弘2 熊晖1*

目的

炎症改变是早发型LMNA-相关肌营养不良的显著病理改变之一，NF-KB是主要的炎症信号传导通路，本研究旨在探讨NF-KB介导的炎症反应在早发型LMNA-相关肌营养不良发病机制中的作用。

方法

构建LMNA野生型和LMNA（I373V）突变型慢病毒表达载体，分别转染至HEK293和C2C12细胞，通过LaminA免疫荧光染色，用confocal观察细胞核形态和LaminA的分布；提取RNA，行实时荧光定量PCR，检测NF-KB的mRNA表达；应用western blot检测NF-KB通路是否激活，检测NF-KB、pNF-KB、IKBa等的表达。同时进行凋亡通路检测，检测Bcl-2、Bax、caspase3和casepase9的表达。

结果

LMNA慢病毒表达载体成功转染入HEK293和C2C12细胞，转染效率高，成功构建稳定转染细胞系。野生型细胞核形态规则近圆形或椭圆形，LaminA沿核膜均匀分布，而突变型可见细胞核形态不规则，有核膜出泡、核膜断裂和染色质漏出等改变，LaminA分布不均匀，部分细胞可见LaminA呈点状分布。实时荧光定量PCR结果提示，突变型较野生型p65的mRNA表达显著升高；通过western blot检测NF-KB通路发现，野生型和突变型NF-KB表达总量无差别，但突变型磷酸化的NF-KB即p65增多，抑制蛋白IKBa起到阻止p65入核的作用，其表达减少；提取核蛋白，发现突变型p65-组蛋白量较野生型明显增加，提示p65入核增多，以上结果提示突变型的NF-KB通路激活。实时荧光定量PCR检测凋亡通路相关蛋白mRNA的表达，发现突变型Bax、caspase3和caspase9的mRNA表达较野生型显著升高，而Bcl-2的mRNA表达显著下降；western blot结果可见突变型的Bax、caspase3和caspase9蛋白表达较野生型显著升高，而Bcl-2的表达显著下降，提示细胞凋亡通路激活。

结论

NF-KB介导的炎症反应参与早发型LMNA-相关肌营养不良发病机制，LMNA突变可激活NF-KB通路，产生炎症反应，进而导致细胞凋亡，引起肌肉萎缩。