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NF-KB介导的炎症反应在早发型LMNA-相关肌营养不良发病机制中的研究

作者:范燕彬 等 日期:2020-08-17 浏览量:90

第七届北京罕见病学术大会暨2019京津冀罕见病学术大会征文(297)

1北京大学第一医院 儿科

2北京大学医学部 基础医学院心血管研究所

范燕彬1 谈丹丹1 张弘2 熊晖1*

目的

炎症改变是早发型LMNA-相关肌营养不良的显著病理改变之一,NF-KB是主要的炎症信号传导通路,本研究旨在探讨NF-KB介导的炎症反应在早发型LMNA-相关肌营养不良发病机制中的作用。

方法

构建LMNA野生型和LMNA(I373V)突变型慢病毒表达载体,分别转染至HEK293和C2C12细胞,通过LaminA免疫荧光染色,用confocal观察细胞核形态和LaminA的分布;提取RNA,行实时荧光定量PCR,检测NF-KB的mRNA表达;应用western blot检测NF-KB通路是否激活,检测NF-KB、pNF-KB、IKBa等的表达。同时进行凋亡通路检测,检测Bcl-2、Bax、caspase3和casepase9的表达。

结果

LMNA慢病毒表达载体成功转染入HEK293和C2C12细胞,转染效率高,成功构建稳定转染细胞系。野生型细胞核形态规则近圆形或椭圆形,LaminA沿核膜均匀分布,而突变型可见细胞核形态不规则,有核膜出泡、核膜断裂和染色质漏出等改变,LaminA分布不均匀,部分细胞可见LaminA呈点状分布。实时荧光定量PCR结果提示,突变型较野生型p65的mRNA表达显著升高;通过western blot检测NF-KB通路发现,野生型和突变型NF-KB表达总量无差别,但突变型磷酸化的NF-KB即p65增多,抑制蛋白IKBa起到阻止p65入核的作用,其表达减少;提取核蛋白,发现突变型p65-组蛋白量较野生型明显增加,提示p65入核增多,以上结果提示突变型的NF-KB通路激活。实时荧光定量PCR检测凋亡通路相关蛋白mRNA的表达,发现突变型Bax、caspase3和caspase9的mRNA表达较野生型显著升高,而Bcl-2的mRNA表达显著下降;western blot结果可见突变型的Bax、caspase3和caspase9蛋白表达较野生型显著升高,而Bcl-2的表达显著下降,提示细胞凋亡通路激活。

结论

NF-KB介导的炎症反应参与早发型LMNA-相关肌营养不良发病机制,LMNA突变可激活NF-KB通路,产生炎症反应,进而导致细胞凋亡,引起肌肉萎缩。