第十一届北京罕见病学术大会暨2023京津冀罕见病学术大会征文(126)

 王琪，俞萌，邓健文，袁云，王朝霞

北京大学第一医院神经内科

目的：镶边空泡肌病（Rimmed vacuolar myopathy， RVM）是指病理上以镶边空泡（Rimmed vacuoles，RVs）肌纤维为主要改变的骨骼肌疾病，分为遗传性和获得性两大类。目前遗传性RVM的研究主要集中在远端型肌病，尚缺乏对遗传性肢带型RVM的系统性研究。本研究旨在分析以RVs为病理学特征的一组遗传性肢带型肌病患者的遗传谱系，总结不同基因型的临床特点，对发现的新致病变异进行功能验证。

材料和方法：通过回顾病理及临床资料，从2019-2021年于本中心行骨骼肌活检的2206例患者中，纳入符合遗传性肢带型RVM的患者：（1）提取患者血液/肌肉组织DNA，首先进行靶向二代测序（Next-generation sequencing， NGS）寻找致病基因，根据ACMG对发现的变异进行致病性评价；对NGS未发现致病变异的患者，1例行重复引物聚合酶链反应（Repeat-primed polymerase chain reaction， RP-PCR）检测NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变，另外4例行全外显子组测序（Whole-exome sequencing， WES）、三代长读长测序、以及家系连锁分析、目的片段PCR扩增等寻找致病基因。分析本组患者的遗传谱系。（2）分析本组患者的临床表现、肌电图、肌肉核磁及肌肉病理结果，总结不同基因型RVM的临床特点。（3）对发现的新致病变异进行功能验证：对患者的肌肉组织进行免疫荧光染色（一抗：抗PLIN4、p62、泛素、porin单克隆抗体）、电镜及免疫电镜检查（一抗：抗PLIN4、p62单克隆抗体）、脂质染料荧光染色及代谢组学分析；培养患者皮肤成纤维细胞，用MyoD腺病毒感染后转染LncMyoD质粒，将皮肤成纤维细胞诱导分化成肌细胞，对该细胞模型进行免疫荧光染色。

结果：（1）共纳入来自22个家系的24例患者，起病年龄为34±17岁，就诊年龄为42±16岁，11例患者有家族史。综合运用多种遗传检测手段，23例患者（95.5%）检测到致病变异，包括DES 9例（42.8%)，FLNC 2例（9.5%）， BAG3 2例（9.5%）， MYOT 1例（4.8%）， LMNA 1例（4.8%），SELENON 1例（4.8%），NOTCH2NLC 5’UTR区GGC重复扩增突变1例（4.8%），PLIN4 3号外显子99bp重复扩增突变3例（9.5%）。23例患者共发现18种变异类型，19例患者为点突变、4例患者为重复扩增突变，患者均为杂合性变异。NOTCH2NLC、PLIN4首次被发现与肢带型RVM相关。（2）结合临床表现、病理特点及基因检测结果，24例患者中16例诊断为肌原纤维肌病（Myofibrillar myopathy， MFM）（66.6%）、3例诊断为VCP肌病（12.5%）、3例诊断为PLIN4动态突变相关肌病（12.5%）、1例诊断为神经元核内包涵体病（Neuronal intranuclear inclusion disease，NIID）（4.2%）及1例诊断为基因未明的RVM（4.2%）。①该组患者均有下肢近端无力，还可出现颈屈肌无力（33.3%）、球部肌肉无力（4.2%）、呼吸肌力弱（8.3%）、周围神经病（12.5%）、认知功能减退（4.2%）、脊柱强直（4.2%）及心肌病、心律失常及心脏瓣膜病（25.0%）。② 实验室检查显示CK多轻度升高（95.8%）；肌电图以肌源性损害最常见（95.0%），VCP、NOTCH2NLC及PLIN4变异的患者合并复合重复放电（25.0%），BAG3及VCP变异患者周围神经传导异常（15.0%）；大腿肌肉核磁显示臀大肌、大收肌明显脂肪化，股直肌、股薄肌相对较轻，此外DES变异患者半腱肌、VCP变异患者长收肌也明显脂肪化。③肌肉病理方面，除了RVs肌纤维外，DES、FLNC、BAG3、MYOT、LMNA及SELENON变异的患者可见胞浆内异常物质沉积（66.7%），PLIN4变异的患者可见膜下及胞浆内异常物质沉积（12.5%），BAG3、VCP变异的患者合并神经源性病理改变（20.8%）， BAG3变异的患者神经活检可见巨轴索有髓神经纤维（4.2%）。PLIN4变异的患者电镜下改变为肌纤维膜下细丝状物质，肌原纤维间膜包裹包涵体和髓样小体。（3）PLIN4基因99bp重复扩增突变患者肌肉组织免疫荧光染色显示，许多肌纤维膜下及胞浆内PLIN4蛋白异常沉积，与泛素/p62共定位；PLIN4及p62免疫电镜显示金颗粒集中分布在肌纤维膜下及膜包裹包涵体内。肌肉组织ORO染色及BODIPY荧光染色显示脂滴无显著增多，代谢组学显示脂质代谢无明显异常。培养皮肤成纤维细胞内未见PLIN4蛋白沉积，但诱导分化成肌细胞后可见胞浆内PLIN4/p62蛋白沉积。

结论：遗传性肢带型RVM具有遗传异质性，本组患者最常见的致病基因是DES，其次是FLNC、BAG3、VCP及PLIN4，突变均呈常染色体显性遗传。最常见的临床诊断是MFM，其次是VCP肌病及PLIN4动态突变相关肌病，NIID患者可以肢带型肌无力为主要表型。PLIN4基因重复扩增突变既可导致常显遗传性肢带型RVM，也可为散发型，RVs伴肌纤维膜下及胞浆内泛素/p62阳性表达是其特征性病理改变。PLIN4基因3号外显子99bp的重复扩增突变可造成蛋白表达上调、异常聚集进而导致自噬溶酶体功能异常，即功能获得性机制致病。患者皮肤成纤维细胞诱导分化成肌细胞后表达突变蛋白，可为后续机制研究提供细胞模型。本研究扩大了遗传性肢带型RVM的基因谱系及临床表型，为不同基因型肢带型RVM患者的临床诊断提供了思路。