第十二届北京罕见病学术大会暨2024京津冀罕见病学术大会（099）

刘艺丹 ^1，2，3      谈丹丹 ^2，3，4      马凯玥 ⁵      罗华夏 ²      毛镜平 ³     罗继航 ^2，3      沈蔷 ³  

    徐陆正 ³      杨诗淇 ^2，3      葛琳 ¹      郭宇轩 ³      张弘 ³      熊晖 ^1，2   *   

1. 首都医科大学附属北京儿童医院

2. 北京大学第一医院

3. 北京大学医学部

4. 南昌大学第一附属医院

5. 上海交通大学

目的：

常染色体隐性遗传LAMA2-先天性肌营养不良（LAMA2-related congenital muscular dystrophy， LAMA2-CMD）以层粘连蛋白-α2（laminin-α2）缺陷为特征，临床表现为广泛对称性肌无力、肌张力减低、脑白质异常信号、关节和脊柱畸形等，是一种高致残率且导致早期死亡的疾病。迄今为止，临床上尚无有效的治疗干预措施。LAMA1基因编码的层粘连蛋白-α1（laminin-α1）与laminin-α2在结构和功能上具有高度相似性，其已被证明是治疗LAMA2-CMD的一种可行的替代蛋白。由于laminin-α1主要在胚胎发育期表达，出生后表达迅速减少，在成人神经肌肉系统中几乎不表达，而LAMA2-CMD患者本身LAMA1基因正常。因此，如何增加内源性全长laminin-α1表达成为重要治疗靶点。

方法：

根据中国LAMA2-CMD患者的高频突变区域，我们建立了一种新的Lama2基因第3外显子缺失的小鼠模型（dy^H/dy^H），该模型具有LAMA2-CMD的早期致死性和典型临床表型。为了实现小鼠体内laminin-α1表达，我们构建了一种腺相关病毒9（adeno-associated virus 9，AAV9）双载体CRISPR激活系统（CRISPR activation，CRISPRa），该系统由靶向Lama1基因启动子的向导RNAs（guide RNAs，gRNAs）、Streptococcus pyogenes来源核酸酶缺陷的Cas9（Streptococcus pyogenes nuclease-deficient Cas9，SpdCas9）、以及转录激活结构域VP64组成。在出生后第3天（P3）对dy^H/dy^H小鼠进行AAV9皮下注射来上调Lama1基因。

结果：

通过AAV9双载体递送CRISPRa，小鼠骨骼肌实现了laminin-α1蛋白表达。在总剂量为1.0 × 10^11载体基因组（vector genomes， vg）治疗的dy^H/dy^H小鼠中，观察到中位生存期翻倍，以及体重和四肢抓力的改善。臀部及后肢肌肉磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、血清生化指标和肌肉病理学研究也显示出显著疗效。股二头肌转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析显示，相较与未治疗的dy^H/dy^H小鼠，Lama1上调后的dy^H/dy^H小鼠有41个差异表达基因更接近野生型水平。当AAV9总干预剂量增加至2.0 × 10^11 vg时，生存期呈现两级分化——近一半小鼠在给药两周内死亡，另一半小鼠生存期得到极大提高，中位生存时间延长至未治疗小鼠的四倍。此外，在干预后不同时间点进行laminin-α1表达检测，发现该蛋白表达量会随时间而下降，与小鼠治疗后终末期表型退步相一致。

结论：

我们的研究表明，dy^H/dy^H可以作为一种合适的LAMA2-CMD疾病模型，用于基因特异性治疗的开发，可以对各种终点进行评估。我们的研究证实了上调Lama1可以作为一种不依赖突变的治疗LAMA2-CMD的方法，早期干预可以改善疾病症状和延长寿命。此外，我们还发现了该方法的局限性，包括高剂量致死风险和laminin-α1的非持续表达，这需要在未来的研究中进一步优化，以评估该疗法的临床适用性。

关键字： 疾病模型， 基因治疗， CRISPRa， 先天性肌营养不良， LAMA2